آماده سازی نمونه پروتئین پیش از مس اسپکترومتری

پیش از انجام مس اسپکترومتری آلودگیهای نمونه باید از آن برداشته شوند و نمونه نسبتا خالص پروتئین/پپتید به دستگاه تزریق می شود.

مرحله خالص سازي پروتئین مي تواند به دو مرحله مجزا تقسيم شود.

– شفاف سازي ( Clarification ): براي برداشتن تركيباتي مانند ليپيدها، نمك ها و پلي مرها كه در مراحل بعدي آناليز تداخل مي كنند.

– غني سازي (Enrichment)، دسته بندي (Fractionation) و جداسازي(Isolation) : اين مرحله براي كاهش پيچيدگي نمونه و افزايش ميزان پروتئين هدف انجام مي پذيرد.

براي شفاف سازي نمونه پروتئين از ليز سلولي مي توان روشهاي مختلفي را به كار گرفت كه برخي از آنها در جدول زير نشان داده شده اند .

جدول1  : روشهاي شفاف سازي پروتئينها (Ref: Jörge von Hagen, Proteomics sample preparation)

Example	Principle method	Method
Addition of salts (e.g. ammonium sulfate), organic solvents (e.g. EtOH, MeOH, Chloroform, acetone) or non-ionic hydrophilic polymers (e.g., dextran, polyethylene glycol).	An agent is added to the lysate wich alters the salvation potential of proteins and lowers the solubility of the protein/solute	Precipitation
Low-spin centrifugation, typically at 1000g for 15 min	Removal of particulates and debris according to mass	Centrifugation
Dialysis, Ultrafiltration (e.g. spinfilters), gel filtration.	Proteins are separated according to size and shape.	Filtration

پيچيدگي نمونه مي تواند در دوسطح پروتئين يا پپتيدكاهش يابد. علاوه بر اين پيش از جداسازي پروتئينها، از روشهاي دسته بندي تحت سلولي ( Subcellular fractionation ) مي توان براي غني سازي گروه خاصي از پروتئينها نيز استفاده كرد. در مجموع اين روشها كمك مي كنند تا از يك سو مقدار پروتئينهاي ناچيز تا حدي كه قابل سنجش با روشهاي پروتئوميكس باشند افزايش يابد و از سوي ديگر مقدار پروتئينهاي با ميزان بالا كاسته شود تا اثر پوشانندگي آنها بر روي پروتئينهاي ناچيز برداشته شود.

جدول 2 : برخی از روشهای غنی سازی و دسته بندی پروتئینها قبل از ESI مس  (Ref: Jörge von Hagen, Proteomics sample preparation)

Example	Principle method	Method
Continuous/discontinuous density gradient ultracentrifugation using sucrose , glycerol , or percollTM.	Separation of proteins, protein complexes, and cellular structures according to mass and / or density.	Ultracentrifugation
Tandem Affinity Purification  ( TAP ) , His –tags .GST-tags.	Proteins of interest are equipped with an affinity tag  ( ‘bait’) used to e.g.idennfy interacting proteins.	Tagging
Aqueous biphasic system  ( e.g. PEG. dextran or triton.PEG/Dextrin).triphasic system comprised of organic solvent and salt (e.g.ammonium sulfate butanol ).May be applied with additional affinity step,e.g.lectin-coupled dextran to further enrich glycosylated proteins.	Proteins are separated according to their charge and hydrophobicity.	Phase-partioning
Ion – exchange , reversed – phase.size-exclusion,affinity chromatography ( e.g.immunoaffinity. IMAC. Immobihzed metal affinity chromatography,and lection-affinity).	Proteins are resolved according to physico chemical properties ( p/,hydrophobicticity .size, charge or via specific binding sites  ( carbohydrate binding, metal binding . antibody epitopes ).	Chromatography
2-D difference gel electrophoresis  (DIGE). Blue native gel electrophoresis,16. BAC/SDS-PAGE, SDS-PAGE.	Proteins are resolved according to isoelectric point and / or molecular weight.	1-D/2-D PAGE

روشMALDI نسبت به روش ESI تحمل بیشتری در برابر آلودگیهای نمکی نمونه دارد. با این حال عمده آلودگیها باید پیش از وارد کردن نمونه در دستگاه برداشته شوند. این کار همچنین می تواند با شستشوی نمونه پس از مخلوط شدن با ماتریکس و بر روی پروب انجام شود (On-probe) .

روشهاي مختلفي براي برداشتن اين تركيبات و يا كم كردن اثر آنها در MALDI ابداع شده است كه عبارتند از : رقيق سازي نمونه ، شستشو ، دياليز ، تعويض كاتيوني و ستونهاي كروماتوگرافي نوك سمپلري.

روش رقيق سازي نمونه روش آساني براي كاهش اثر تركيبات آلوده كننده است . اما بايد اثر رقيق سازي بر روي آناليت نيز مد نظر قرار گيرد.

در یک روش شستشوی کریستالهای ایجاد شده از پپتید و ماتریکس با آب مقطر سرد  اسیدی شده توسط 0.1 % تری فلورو استیک اسید گزارش شده است. به هنگام تشکیل کریستال پپتید و ماتریکس مواد متداخل بیرون از کریستال باقی می مانند. بنابراین شستشوی کریستال می تواند آنها را خارج نماید.

در روش دیگری تعداد  هسته های کریستالی را افزایش می دهند ، هرچه این هسته کریستالی ( Nucleation site) متعدد باشد نمک بیشتری از ترکیب جدا می شود.

در روش شستشو اغلب از بافرهاي حاوي آمونيوم استفاده مي شود. بهترين نتايج با شستشوي كريستالها توسط بافر mM10 – 5 دي آمونيوم سيترات بدست آمده است. اضافه كردن نمك آمونيوم مانند /آمونيوم فسفات مونوبازيك (mM10 – 4 ) به ماتريكس مي تواند در بهبود نتايج تاثير زيادي داشته باشد. مي توان شستشو و اضافه كردن آمونيوم به ماتريكس را بصورت تركيبي به كار گرفت.  

دیالیز قطره ای روش دیگری برای کاهش آلودگیهای نمونه است. این روش برای برداشتن ترکیبات با وزن مولکولی پایین مانند نمکها و دترجنت ها مناسب است. دراین روش می توان از قرار دادن یک قطره TFA %1/0 در محل نمونه برای جذب آلودگی ها استفاده کرد. وپس از چند ثانیه می توان TFA را بوسیله کاغذ خشک کن از محل برداشت.

استفاده از زرین هاي حاوی NH⁴⁺ می تواند در واکنش تعویض یونی سبب برداشتن یونهای فلزی قلیایی از محیط گردد. استفاده از این روش در آنالیز الیگو نوکلئوتید ها رایج است و در آنالیز پروتئینها و پپتیدها به دلیل تمایل اتصال آنها به پپتیدها نباید مورد استفاده واقع گردد.

ستونهای کروماتوگرافی سر سمپلری اشکال مینیاتوری ستون کروماتوگرافی هستند. یک نوع تجاری آنها تحت عنوان   ZIP TIP (Millipore ) در دسترس هست. پر و خالی کردن نمونه در این سرسمبلرها می تواند سبب جذب آلودگیهای نمکی به ستون شده و سبب پاکسازی نمونه گردد.

از جمله آلودگیهای محیطی که می تواند تداخل در مس اسپکترومتری نماید کراتین ناشی از آلودگیهای پوستی است. به هنگام تهیه نمونه جهتMS باید با پوشیدن دستکش و کارکردن در شرایط تمیز از امکان آلودگی کراتین جلوگیري کرد.

روشهاي مختلفي براي مخلوط كردن نمونه و ماتريكس و اضافه كردن آن  به MALDI توصيف شده است. از آن جمله مي توان روشهاي قطره خشك ( Dried droplet )، لايه نازك يا تبخير سريع (Thin – layer or fast evaporation ) و روش ساندويچ ( Sandwich method  ) را نام برد.

در روش قطره خشك، ماتريكس و آناليت يا از ابتدا مخلوط شده و بعد بر روي پليت MALDI نمونه گذاري مي شود و يا در روي پليت با هم مخلوط مي شوند. اين روش با بسياري از ماتريكسها قابل انجام است و تحمل آن به حضور نمك بالاست . در مواردي كه پروتئينهاي هيدرو فوب مورد سنجش است اضافه كردن 5 الي 30 درصد اسيد فرميك به جاي تري فلورو استيك اسيد ( TFA  ) / ايزوپروپانول به CHCA توصيه شده است .

در روش لایه نازک، نمونه و ماتریکس جداگانه منتقل می شوند که سبب تسهیل در آماده سازی نمونه شده و حساسیت و رزولوشن را در آنالیز پپتید افزایش می دهد. در این روش ماتریکس در یک حلال بسیار فرار مانند استون حل می شود و سپس بر روی پلیت MALDI قرار می گیرد. پس از تبخیر حلال یک فرم کریستالینه از ماتریکس بر روی پلیت تشکیل خواهد شد . دراین حالت می توان آنالیت را که به صورت مایع است در سطح ماتریکس پخش کرد و پس از خشک شدن مس اسپکترومتری انجام می شود. باید توجه نمونه ماتریکس نباید در حلال آنالیت حل شود. این روش می تواند سبب بکارگیری پلیت های یکبار مصرفMALDI که ماتریکس از قبل بر روی آنها لود شده است می گردد و از طرفی امکان شستشوی آنالیت در سطح پلیت را فراهم میکند که این کار از آلودگیهایی نمکی نمونه می کاهد. برای جلوگیری از کنده شدن آنالیت به هنگام شستشو می توان نیتروسلولز به ماتریکس اضافه کرد.

روش ساندویچ عیناً مانند روش لایه نازک است با این تفاوت که پس از اضافه کردن آنالیت و خشک شدن آن یک لایه ماتریکس مجدداً نمونه را می پوشاند.  

روشهای دیگری هم توسط محققین مختلف توصیه شده که جزئیات آنها را از مقالات تحقیقی می توان استخراج نمود.

 نمونه هاي بيولوژيك اغلب حاوي تركيباتي شامل بافرها، نمك ها و دترجنت ها هستند كه مي توانند در نتايج     MALDI تداخل نمايند. برخي از تركيبات موجود در اين نمونه ها و امكان تداخل آنها درMALDI جدول زير نمايش داده شده است .

جدول3  : تركيبات آلوده كننده موجود در نمونه هاي پروتئين / پپتيد و تاثير آنها برروي MALDI.  (Ref: Jörge von Hagen, Proteomics sample preparation) 

Avoid	Tolerable (<50mM)a	No interference
. Glycerol . Sodium azide . DMSO . SDS . Phosphate . NaCl . 2M urea . 2M guanidine hydrochloride	. HEPES . MOPS . Tris . NH4OAC . Octyl glucoside	. TFA . Formic acid . β-Mercaptoethanol . DTT . Volatile organic solvents . HCL . NH,OH . Acetic acid

^aMinimizing buffer concentrations improves performance.

Use the minimum needed to control pH.

DTT, dithiothreitol, SDS. Sodium dodecylsulfate.

 مس اسپکترومتری ESI امکان استفاده از روش LC را به عنوان یک روش مناسب برای پاکسازی نمونه پیش از وارد شدن آن به MS فراهم نموده است . علاوه براین در این روش پروتئینها و پپتیدها به تدریج از ستون جدا شده و وارد دستگاه MS می گردند که سبب تسهیل در شناسایی وافزایش دقت و حساسیت می گردد . علاوه بر LC  ، روشهای مقدماتی دیگر می تواند پیش از مس اسپکترومتری سبب آماده سازی نمونه گردد که شامل چندین مرحله مانند نمک زدایی ، تغلیظ ، روشهای fractionation و جداسازی توسط روشهای الکتروفورز و کروماتوگرافی باشد .

نکته مهم در طول فرایند آماده سازی نمونه ، باقیماندن پروتئینها در حالت محلول و حفظ ساختار آنهاست. با وجود روشها و مواد متعددی که در آماده سازی نمونه پروتئین برای آزمایشات دیگر پروتئومیکس به کار گرفته می شوند، به دلیل عدم سازگاری برخی از این مواد و روشها با MS ، نمی توان آنها را در آماده سازی نمونه جهت مس اسپکترومتری به کار گرفت.

با افزایش تعداد پروتئین در نمونه هایی مانند پروتئین کامل حاصل از لیز سلولی، مخلوط پیچیده ای از پپتیدها پس از تجزیه آنزیمی به دست خواهد آمد که شناسایی پروتئین ها را بسیار پیچیده می کند. با اینحال با استفاده از روشی تحت عنوان تکنولوژی چند بعدی شناسایی پروتئین ) (Multi – dimensional protein identification technology, MudPIT این کار عملی شده است . در این روش از قدرت تمایزی چندین مرحله کروماتوگرافی مانند  Reversed – phase , Strong cation – exchange پیش از وارد شدن پپتیدها به MS و سپس از رزولوشن بالای MS / MS برای شناسایی پروتئینها/پپتيدهاي متعدد موجود در نمونه استفاده می گردد. قابلیت اتصال HPLC وESI  مس اسپکترومتری سبب شده تا  علاوه بر بالا رفتن حساسیت ، صرفه جویی زیادی در زمان انجام آزمایش نیز صورت پذیرد.

روشهاي متعددي براي جداسازي پپتيدها و پروتئينها پيش ازMS وجود دارد كه از جمله انها مي توان روش كروماتوگرافي فاز معكوس ، exclusion – Size , تعويض يوني ، الكتروفورز2-D  و غيره را نام برد . روش به كار رفته مي تواند بصورت Offline ( يعني جداگانه انجام شود و سپس پروتئينها با پپتيدهاي جدا شده براي مس اسپكترومتري برداشته و استفاده گردد ) و يا به صورت Online ( يعني قطعات جداشده به تدريج و به محض جدا شدن بصورت خودكار وارد مس اسپكترومتر گردد ) باشد .

ستون کروماتوگرافی  که قطر آن بزرگتر از 300 میکرومتر باشد را ستون میکروبور  (Microbore  column) می گویند . در مقابل ستونهای کوچکتر از این حد را  ستونهای موئينه اي (Capillary column)می گویند ( معمولا در حد 100-50 ). ستونهای میکروبور برای پروتئینهای با مقدار بیشتر ( در حد شناسایی با کوماسی ) استفاده می شوند و ستونهای میکروکپیلاری برای مقادیر کمتر ( در حد سنجش رنگ آمیزی نقره ) است.

 انتقال پپتید از ستون به ESI طوری تنظیم می شود که مقدار کافی از پپتید وارد  دستگاه مس  اسپکترومتری گردد و مازاد آن ، تحت عنوان Post – Column Flow – Splitter از ستون خارج شده و بازیافت گردد. این مقدار اضافه می تواند جهت آزمایشات  تکمیلی مانند بررسی فسفریلاسیون پپتیدهای لیبل شده با ³²P با روشهای دیگر ( شمارش Scintillation )  مورد استفاده واقع  شود.

میزان جریان فاز مایع  (Flow  rate ) در ستون نیز باید در حد کمتر از میکرولیتر در دقیقه و بصورت تثبیت شده  باشد. حلال های آلی که معمولا از استونیتریل  استفاده می شود باید بصورت شیب غلظتی افزایش یابنده  وارد ستون شوند. تنظیم شیب غلظتی می تواند با دستگاه خودکار و یا بصورت دستی باشد.

جداسازي پروتئينها ممكن است بصورت گزينشي صورت گيرد كه در اين صورت اين مرحله را Prefractionation مي گويند. براي مثال ممكن است اين مرحله براي جداسازي اختصاصي پروتئينهاي فسفريله شده براي مس اسپكترومتري باشد.

جداسازی پروتئینها بر روی ژل الکتروفورز و سپس استفاده از پروتئینهای جداشده در تزریق به MS یک روش Offline  محسوب می شود. در این روش هر پروتئین بصورت جداگانه مورد بررسی قرار می گیرد که آنالیز داده ها را بسیار آسانتر می کند. با این حال آماده سازی نمونه بسیار زمانبر و خسته کننده خواهد بود.

در الكتروفورز SDS روش 2-D به دلیل قابلیت جداسازی بیشتر پروتئینها از یکدیگر نسبت به D-1 اهمیت بیشتری دارد . این روش پس از انجام قادر است اطلاعات اولیه  در مورد پروتئینها مانند وزن مولکولی ، نقطه ایزوالکتریک (PI ) ، میزان نسبی پروتئین و احتمال تغییرات پس از ترجمه (PTM  )  را نشان دهد . که در دست داشتن این اطلاعات  کمک زیادی در تفسیر اطلاعات  بدست آمده از MS خواهد کرد .

 سه محدودیت عمده  D– 2  عبارتند از: 1- اغلب پهنه PI   به کار گرفته شده محدود  است . اگرچه امروزه روشهای جدید این پهنه را به میزان چشمگیری افزایش داده اند (11-pH 3  ). 2- پروتئینهای سنگین معمولا به سختی در D  – 2 جدا میشوند به نحوی که پروتئینهای بالای kD 150 را نمی توان در روی ژل دید . این پروتئینها ممکن است بر روی D -1  قابل مشاهده باشند . 3- پروتئینهای آب گریز معمولا تمایلی به جداشدن در 2-D ندارند و حذف می شوند .

با در نظر گرفتن هر کدام از محدودیت های فوق از روش D-1 می توان برای جداسازی  استفاده کرد . اما در این روش همیشه احتمال حضور همزمان  دو یا چند پروتئین  در نقطه مشخص از ژل وجود دارد .

روشهای رنگ آمیزی پروتئین بر روی ژل

 بسیاری از رنگ آمیزیهای موجود  برای پروتئینها با آزمایشات مس اسپکترومتری سنخیت دارند.  با این حال روشهای کوماسی و رنگ آمیزی نقره به دلیل آسان بودن و سریع انجام شدن  نسبت به بقیه ارجحیت دارند. حساسیت روش کوماسی در حد 0.1 میکروگرم و حساسیت  روش نقره در حد 1 نانوگرم ( 100 برابر حساستر از کوماسی ) است .

 در روش عمومی رنگ آمیزی نقره معمولا از گلوتار آلدئید و فرمالدئید برای فیکس کردن  استفاده می شود. اما اگر هدف استفاده از پروتئینها برای مس اسپکترومتری است باید از روش تغییر یافته نقره استفاده نمود که این دو ماده را جهت فیکس کردن استفاده نمی کند . فیکس کردن  پروتئین توسط فرمالدئید و گلوتارآلدئید سبب اختلال  در هضم  آنزیمی و نیز استخراج پپتیدها برای مس اسپکترومتری می شود.

 روش دیگری که از نظر حساسیت همانند رنگ آمیزی نقره  بوده و قابل استفاده پیش از مس  اسپکترومتری است رنگ آمیزی معکوس ایمیدازول – SDS – روی است. همچنین از رنگ های فلورسنت مانند SYPRO قرمز و نارنجی نیز می توان استفاده نمود.  روش دیگری که توسط Van Oostreen ابداع  شده  استفاده  همزمان از آمیدوبلک و نقره کلوئیدی است. این روش را به عنوان یک روش سریع می توان برای  رنگ آمیزی غشائ نیتروسلولزی به کار برد . از رنگ آمیدوبلک و پانسو S به تنهایی نیز می توان برای رنگ آمیزی غشاء استفاده کرد. اما حساسیت این دو تقریباً مانند کوماسی و در حد 100 نانوگرم است .

هضم  آنزیمی پروتئین در ژل

 یکی از روشهای متداول برای استخراج پپتید از ژل جهت مس اسپکترومتری  استفاده از روش  هضم آنزیمی است . در این روش معمولا از تریپسین استفاده می شود. تریپسین  قادر است  باند پپتیدی را پس از لیزین و آرژنین (در ناحیه C ترمینال ) برش دهد .  البته زمانی که اسیدآمینه بعدی پرولین ( Pro ) باشد  این برش انجام نمی گیرد. به دلیل داشتن انتهای بازی جانبی در دو اسیدآمینه لیزین و آرژنین قرار گرفتن این دو اسید آمینه در انتهای C قطعات بریده شده سبب می شود تا هنگام مس اسپکترومتری  مخصوصا ESI-MS  اغلب قطعات پپتیدی بار 2  + به خود بگیرند ( 2H⁺)  ( یکی از انتهای N و دیگری در انتهای C  ) . این موضوع  تفسیر اسپکترای بدست آمده از CID را آسانتر می کند.

 اگر بخواهبم مبزان بیشتری از پپتیدهای پروتئین را در MS مورد شناسایی قرار دهیم بهتر است  پیش از هضم آنزیمی واکنشهای احیاء ( Reduction ) و آلکیلاسیون ( Alkylation ) بر روی پروتئین انجام شود . این واکنشها می تواند توسط ِDTT و آیودواستامید انجام گیرند . 

 باید توجه داشت هضم آنزیمی ناقص ، ایجاد  یا حضور مدیفیکیشنهای ناشناخته می توانند  الگوی پپتیدی بدست آمده را تغییر داده و سبب شناسایی غلط پروتئین گردند. با اينحال بطور معمول ممكن است برخي از نواحي برش در ميان قطعات پپتيدي باقي بمانند كه به آن Missed cleavage گويند. هرچه طول پروتئین کوتاهتر باشد احتمال شناسایی آن با روش  Fingerpriting کمتر می شود .  علاوه بر آیودواستاماید می توان از 4- وینیل پیریدین هم برای آلکیلاسیون استفاده کرد .  در این واکنش اسیدهای آمینه سیستئین آلکیله می شوند (اضافه شدن گروه آلکیل ).  اگر از مس اسپکترومتری ESI-MS  استفاده شود  ممکن است S – پیریدیل اتیلاسیون ( S- Pyridyl ethylation ) سبب ایجاد یک بار مثبت بر روی گروه  آلکیل گردد. به همین دلیل تشکیل قطعات +3  (3H⁺) در ESI-MS   رایج است.

 ژل آکریل آماید با %12-15 آکریل آماید برای هضم آنزیمی مناسب است . باید توجه نمود که افزایش درصد آکریل آماید ممکن است میزان نفوذ  نریپسین را در ژل کاهش دهد و بنابراین هضم آنزیمی با بازده کمتری صورت گیرد.

هضم آنزیمی بر روی غشاء

 هضم آنزیمی پروتئین می تواند بر روی غشاء PVDF یا نیتروسلولز انجام گیرد. این روش نسبت  به روش ژل سریعتر انجام می گیرد. اما انتقال پروتئین بر روی غشاء همیشه همراه با  از دست دادن مقادیری از آن است . این روش اغلب برای بررسی فسفریلاسیون  پروتئینها  پس از لیبل کردن آنها با   ³²P و با استفاده ازمس اسپکترومتری مناسب است . چرا که به راحتی می توان جایگاه پروتئین لیبل شده را بر روی غشاء با مجاور کردن آن با فیلم عکاسی شناسایی کرد .