رنگ آمیزی پروتئین به روش فلورسانس

رنگ آمیزی فلورسانس از نظر اساس روش به رنگ آمیز کوماسی شبیه است. در اینجا نیز ماده فلوروفور بصورت کووالانسی یا غیر کووالانسی به پروتئین متصل می شود. البته این رنگ آمیزی در عمل به مراتب دشوارتر از رنگ آمیزی معمولی است. پس از جذب ماده فلوروفور به پروتئین، آن باید قابلیت ساطع سازی نور فلورسانس را حفظ نماید و بازده كوانتوم (Quantum yield) خود را كه عبارت است از نسبت فوتونهاي ساطع شده به فوتونهاي جذب شده، در حد اعلا حفظ نمايد. اگر به هردلیل این قابلیت از بین برود و یا به دلیل قرار گرفتن در محیط شیمیایی جدید از قابلیت آن کم شود این ماده نمی تواند به عنوان فلوروفور مناسب مورد استفاده قرار گیرد. برای مثال بعضی از فلوروفورها در محیط آبی بهتر واکنش می دهند. اما به محض قرار گرفتن در محلولهای غیر قطبی از فعالیت تشعشعی آنها کاسته می شود و یا برعکس.
نکته مهم دیگر نیازمند بودن این روش به تجهیزات پیشرفته است. برای پی بردن به لزوم به کارگیری این گونه تجهیزات باید به ماهیت طول موج لازم جهت تحریک فلورسانس (Excitation) و طول موج ساطع شده (Emission) توجه نمود. معمولا ً هر ماده فلوروفور در یک یا تعداد محدودی از طول موجهای نور جذبی فعال می گردد. بنابراین برای گرفتن نتیجه خوب باید از منبع نوری استفاده شود که قادر باشد طول موج مورد نیاز را تولید کند. اما اگر طول موج تابیده شده و طول موج ساطع شده یکی باشد و یا خیلی نزدیک به هم باشند نمی توان سیگنالهای ناشی از فلورسانس را ثبت نمود. بنابراین در حالت ایده آل ماده فلوروفوری که اختلاف طول موج جذبی و ساطع شده آن زیاد باشد بهتر است. همچنین اگر از دو ماده فلوروفور جهت رنگ آمیزی یک نمونه استفاده می شود، باید فاصله طول موج جذبی و ساطع شده آنها در حدی باشد تا قابل تمایز از یکدیگر باشند. از مهمترین مزایای این روش حساسیت بسیار بالای آن ، خطی بودن نمودار تشعشع و امکان اضافه کردن به پروتئینها قبل از الکتروفورز است. خطی بودن نمودار تشعشع خصوصیت مهمی است که امکان استفاده از این رنگ آمیزی در آنالیزهای نیمه کمی پروتئینها را می دهد.
در مورد امکان اضافه کردن رنگ فلورسانس به پروتئین نیز باید توجه نمود که در الکتروفورز دو بعدی که حرکت پروتئینها براساس نقطه ایزوالکتریک (PI) آنها در مرحله اول انجام می شود و رنگ می تواند PI را تغییر دهد این کار با تمهیدات خاصی انجام مي گیرد. برای مثال روشهایی در استفاده از پروبهای خنثی، پروبهايي كه با گروه تیول واکنش می دهند و یا پروبهايي كه با گروههاي آميني واكنش مي دهند اما واجد يك بار مثبت براي جايگزيني بار مثبت از دست رفته هستند گزارش شده است. همچنین می توان ماده فلوروفور را در حد فاصل IEF و SDS PAGE اضافه کرد.استفاده از مواد فلوروفوری که پس از اتصال به پروتئین قابلیت فلورسانس پیدا می کنند مانند فلورسکامین (Fluorescamine) و یا (MDPF) 2-methoxy-2,4-diphenyl furanone نسبت به آنهایی که از ابتدا این خاصیت را دارند ارجحیت دارد. چرا که با این روش تا حدودي از رنگ فلورسانس زمينه كاسته مي شود.
روش ديگر در رنگ آميزي فلورسانس استفاده از پروبهاي غير كووالانسي ، حساس به محيط است. اين پروبها اغلب بسيار خاصيت فلورسانس ضعيفي در آب دارند اما در محيط غير قطبي مانند مانند دترجنت فلورسانس قوي پيدا مي كنند.
در نتيجه مي توان از خاصت اتصالي دترجنت به پروتئين براي عمل كردن به عنوان فعال كننده خاصيت فلورسانسي در مجاورت پروب استفاده كرد. برخي از بهترين انواع پروبهايي كه به اين طريق عمل مي كنند عبارتند از ANS (Anilino naphthalene sulfonate) ، Bis ANS ،Sypro و Nile Red