رنگ آمیزی به روش کاهندگی یونهای فلزی (رنگ آمیزی نقره)

رنگ آمیزی نقره مانند رسوب افتراقی نمکها بر پایه اتصال کاتیون به پروتئین است. کاتیون مورد استفاده در اینجا نقره می باشد که علاوه بر پروتئین می تواند توسط عوامل دیگری مانند SDS، یون کلراید و اسیدهای آمینه نیز جذب شود. لذا پیش از مجاور سازی آن با پروتئین باید تمام این عوامل از محیط خارج شوند. برای این منظور تمهیداتی باید به کار گرفته شود. برای مثال آب مقطر مورد استفاده باید کاملا ً عاری از یونها از جمله کلراید باشد(آب مقطر دیونیزه). همچنین مرحله تثبیت و شستشوی ژل پیش از رنگ آمیزی لازم است. هر چه تمایل جذبی پروتئین به یونهای نقره زیادتر باشد حساسیت روش بالاتر می رود.برای این منظور استفاده از ترکیباتی که اغلب حساس کننده یا Sensitizer نامیده می شوند این هدف را برآورده می کنند.
نقره اغلب به شکل ترکیب نیترات نقره یا محلول آمونیاکی نقره استفاده می شود. معمولا ً برای نیترات نقره از فرمالدئید در محلول کربونات قلیائی به عنوان دولوپر (Developer) استفاده می شود. اما برای نقره آمونیاکی از فرمالدئید به همراه یک محلول اسیدی مانند محلول اسید سیتریک به عنوان دولوپر استفاده می شود.
باید توجه نمود که استفاده از فرمالدئید هنگامی که می خواهیم پروتئین را جهت شناسایی با مس اسپکترومتری مورد استفاده قرار دهیم توصیه نمی شود.
محلول آمونیاکی نقره برای رنگ آمیزی پروتئینهای بازی بهتر است اما باید توجه شود که خارج شدن گاز آمونیاک از محلول سبب به هم خوردن نسبت نقره به آمونیاک شده و نتایج نامطلوبی در رنگ آمیزی بدست می آید.
مراحل رنگ آمیزی نقره به این شکل است:
⦁ تثبیت: در این مرحله پروتئینها تثبیت شده و مواد متداخل شسته می شوند.
⦁ حساس سازی يا اكسيد كردن: در این مرحله مواد حساس کننده تمایل جذبی پروتئین به نقره را افزایش می دهند. اين كار با اكسيد كنندگي پروتئينها انجام مي پذيرد.
⦁ اضافه کردن نقره
⦁ مرحله رنگ زایی(Development) در این مرحله نقره متصل شده به پروتئین بصورت نمک غیر محلول قابل رویت در می آید.
⦁ مرحله توقف واکنش
ما بین این مراحل معمولا ً یک مرحله شستشو با آب لازم است.
بطور کلی هرچه مرحله تثبیت طولانی تر باشد بهتر است، اما به هرحال این مرحله نباید از محدوده زمانی خاصی کمتر باشد.
مرحله شستشوی پس از حساس سازی از اهمیت خاصی برخوردار است. چرا که اگر مواد حساس کننده از زمینه شسته نشوند سبب اتصال نقره به زمینه (ژل) شده و رنگ آمیزی مطلوبی بدست نمی آید.
پس از مرحله اضافه کردن نقره، شستشوی طولانی سبب برداشته شدن نقره متصل به پروتئین شده و حساسیت رنگ آمیزی را کاهش می دهد. با این حال شستشوی کوتاه نیز سبب باقی ماندن نقره اضافی در زمینه شده و سبب تاریک شدن زمینه رنگ آمیزی می شود. به همین دلیل زمان شستشوی این مرحله باید به دقت تعیین گردد.
در مرحله رنگ زایی باقی ماندن مواد Developer در مجاورت ژل به مدت طولانی سبب تاریک شدن زمینه می شود. زمان این مرحله باید به دقت تعیین گردد. همچنین پیش از شروع این مرحله باید ماده متوقف کننده واکنش را آماده نموده و در دسترس قرارداد تا به محض رسیدن شدت رنگ به مرحله مطلوب با اضافه کردن آن از ادامه واکنش جلوگیری شود. باید توجه نمود که از مرحله اضافه کردن ماده توقف کننده تا توقف کامل واکنش ممکن است فاصله زمانی خاصی لازم باشد. بنابراین بهتر است همیشه کمی پیش از رسیدن رنگ آمیزی به نقطه مطلوب ماده متوقف کننده اضافه گردد.
پس از اضافه کردن Developer در لحظات اولیه ترکیبات نامحلول قهوه ای رنگ کربنات نقره به سرعت تشکیل می شوند. اگر در این لحظه محلول حرکت داده نشوند این ترکیبات در سطح ژل رسوب کرده و سبب تاریک شدن ژل می گردند. اما حرکت دادن محلول رنگ آمیزی به همراه ژل سبب برگشت این نمک به حالت محلول می گردد.
در تمام مراحل رنگ آمیزی پوشیدن دست کش ضروری است. هم به جهت جلوگیری از آلودگی ژل با پروتئینهای پوستی و هم به جهت محافظت دست ها. با اين حال استفاده از دستكش لاتكس توصيه نميشود چرا كه مي تواند منبع آلودگي با پروتئينهاي لاتكس باشد. همچنین شستشوی ظرفهای رنگ آمیزی و آب کشی مناسب آنها از اهمیت بالایی برخوردار است.
محلول فرمالدئید را هرگز نباید در یخچال نگهداری کرد چرا که به شکل پلی مریزه در خواهد آمد.
اگر از محلول نقره آمونیاکی استفاده می شود باید همواره از خشک شدن این ترکیب جلوگیری گردد. چرا که این ترکیب ممکن است تبدیل به Silver azide شود که یک ماده انفجاری است. برای این منظور ابتدا باید ظرف با آب مقطر شستشو گردد و سپس محلول حاوی نقره در ظرفی که حاوی کلرید سدیم یا یک ماده احیاء کننده مانند اسید آسکوربیک است جمع آوری گردد. این مواد سبب رسوب نقره خواهند شد.
بطور کلی رنگ آمیزی نقره نسبت به رنگ آمیزی کوماسی و رسوب افتراقی نمکها از حساسیت بالایی برخوردار است ( در حد الی ). بطوری که حساسیت آن 100 بار بیشتر از رنگ آمیزی معمولی کوماسی، 10 بار بیشتر از کوماسی کلوئیدی و 2 بار بیشتر از رسوب افتراقی نمکها می باشد.
این رنگ آمیزی برای پروتئینها و اسیدهاي نوکلئیک به کار می رود. برخي از نكاتي كه در هنگام رنگ آميزي نقره بايد مورد نظر قرار گيرند به شرح زير است.
ژل را می توان در محلول تثبيت كننده ( %40 متانول و %10 اسید استیک ) تا هنگام رنگ آمیزی نگهداری کرد.
بهتر است از متانول مطلق استفاده شود اگر متانول مطلق در دسترس نبود می توان از محلول 40% موجود در بازار استفاده کرد و برای ساختن محلول ثبوت (Fixing) فقط استیک اسید اضافه می شود.
حضور یک پروتئین با غلظت بالا در ژل، به همراه پروتئینهای با غلظت پائین سبب خواهد شد تا هنگام رنگ آمیزی نقره پروتئین غلیظ آنقدر پررنگ شود که سبب پوشیده شدن باندهای دیگر گردد. بنابراین اولا ً از لود کردن دو نمونه که اختلاف غلظت پروتئین (خیلی زیاد و خیلی کم) دارند در کنار هم برای رنگ آمیزی نقره همزمان باید اجتناب کرد. ثانیا ً اگر پروتئین غلیظ در یک نمونه به همراه پروتئینهای رقیق وجود دارد. از روشهای Pre-Fractionation برای حذف پروتئین غلیظ يا کاهش غلظت آن باید استفاده کرد تا بتوان باندهای پروتئینهای دیگر را مشاهده نمود.
حضور ماده اکسید كننده در ژل پس از شستشو می تواند باعث افزایش رنگ زمينه گردد. لذا تعویض آب مخصوصا ً در چند دقیقه اول شستشو ضروری است. ژلهای رنگ آمیزی شده به روش کوماسی بلو را می توان پس از رنگ بری با محلول ثبوت مجددا ً با نقره رنگ آمیزی کرد.
رنگ آمیزی نقره برای DNA و RNA نیز کاربرد دارد. در این حالت اسید استیک را باید از محلول ثبوت حذف کرد. ضمنا ً DNA و RNA باید روی SDS الکتروفوروز شده باشند. DNA و RNA که روی آگارز لود شده باشند برای رنگ آمیزی نقره مناسب نیستند. اگر پس از افزودن دولوپر بروز باندها به کندی صورت گیرد گرم کردن محلول دولوپر تا 50 درجه می تواند آنرا تسریع کند. اگر باندهای بدست آمده ضعیف است یا باند مورد نظر دیده نمی شود می توان ژل را بعد از رنگ آمیزی مجددا ً در آب مقطر قرار داد. (30 دقیقه) و رنگ آمیزی را از مرحله اضافه کردن محلول نقره دوباره تکرار کرد.