رنگ آمیزی پروتئین به روش کوماسی بلو

رنگ آمیزی کوماسی بلو از جمله روشهای رنگ آمیزی آلی به حساب می آید. در رنگ آمیزیهای آلی رنگ می تواند بصورت کووالانسی یا غیر کووالانسی با پروتئین واکنش دهد. در حالت ایده آل باید رنگ تمایل اتصال به زمینه نداشته باشد. از آنجا که ممکن است اتصال رنگ سبب تغییر نقطه ایزوالکتریک (PI) و وزن مولکولی (MW) پروتئین شود بهتر است همیشه رنگ آمیزی بعد از الکتروفورز صورت بگیرد. رنگ هایی که با پروتئین واکنش کووالانسی دارند اغلب به گروههای فعال آمینی یا تیولی متصل می شوند بنابراین حضور عواملی مانند تریس و آمفولیت های حامل (Carrier ampholytes) در محیط سبب جذب رنگ شده و کیفیت رنگ آمیزی را کاهش می دهند. در چنین مواردی اغلب یک مرحله شستشو و تثبیت (Fixation) به مرحله رنگ آمیزی اضافه می شود.
از جمله رنگ هایی که با پروتئین واکنش کووالانسی ندارند رنگ های خانواده تری فنیل متان هستند. در این خانواده رنگ های بریلیانت بلو G و R که تحت عنوان رنگ های کوماسی بلو معروفند قرار دارند. از جمله عواملی که با این رنگ ها تداخل دارند SDS هست که بهتر است پیش از رنگ آمیزی و در مرحله تثبیت شسته شده و از محیط خارج شود. رنگ آمیزی کوماسی بلو یک رنگ آمیزی تهاجمی (Regressive) به حساب می آید. به این معنا که ابتدا همه ژل رنگ آمیزی شده و سپس براساس تمایل بیشتر پروتئین به رنگ طی مرحله رنگ زدایی رنگ های متصل شده به زمینه (ژل) شسته می شود. رنگ آمیزی کوماسی یک رنگ آمیزی آنیونی است و لذا در محیط اسیدی بهتر عمل می کند.
مراحل رنگ آمیزی کوماسی بصورت زير است:
تثبیت و شستشو (محلول حاوی اتانل و استیک اسید): جهت برداشتن SDS و تثبیت پروتئین در ژل
رنگ آمیزی
رنگ زدایی (محلول حاوی اتانل و استیک اسید): جهت برداشتن رنگ از زمینه
اگر هدف رنگ آمیزی استفاده از پروتئین جهت توالی یابی است باید میزان استیک اسید در تمام مراحل در حد %0.5 باشد.
عمده ترین محدودیت روش کوماسی بلو حساسیت پایین آن است. علاوه بر حساسیت پایین، کوماسی که یک رنگ آمیزی تهاجمي است به دلیل دو مرحله رنگ آمیزی و رنگ زدایی ممکن است تکرار پذیری خوبی نداشته باشد.
برای افزایش تکرار پذیری چند روش پیشنهاد شده است. برای مثال رنگ آمیزی پروتئین در حین حرکت آن در ژل SDS ، و یا رنگ آمیزی با محلول رنگ با غلظت پایین و روش کلوئیدی کوماسی بلو از جمله این روشها هستند.
در روش اخیر بریلیانت بلو G بصورت کلوئیدی در محلول اسیدی شامل آمونیم سولفات در می آید. این روش برای بریلیانت بلو R مناسب نیست. در این روش رنگ تمایل کمی به زمینه دارد و رنگ زمینه با یک شستشوی ساده توسط آب برداشته می شود، با این حال زمان رنگ آمیزی نسبت به رنگ آميزي معمولی طولانی تر است. براي جلوگيري از آلودگي، رنگهاي استفاده شده را نبايد مجددا مورد استفاده قرار داد.