روش برادفورد ( Bradford )

روش برادفورد یک روش رنگ سنجی است که در سال1976 توسط ماریون برادفورد ابداع شد. این روش بر اساس اتصال رنگ کوماسی به آرژنین و ترکیبات حلقوی دیگر مانند تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین و فنیل آلانین است. لذا كار آيي تست به حضور اين اسيد آمينه ها در ساختار پروتئين بستگي دارد. رنگ کوماسی بلو در حالت معمول یک رنگ قرمز متمایل به قهوه ای دارد. اما هنگامی که در مجاورت پروتئین قرار میگیرد با گروه های کربوکسیل پروتئین اتصال واندروالسی و با گروه های آمینو اسیدی اتصال الکترواستاتیک برقرار می کند و رنگ کوماسی به فرم آنیونی که آبی رنگ است تبدیل میشود. در این حالت جذب ماکزیمم رنگ که در محیط اسیدی در طول موج  465 نانومتر است به جذب ماکزیمم در 595 میرسد .

از مزایای روش برادفورد سریع بودن، ارزان بودن و اختصاصی بودن و حساسیت بالا و پایدار بودن رنگ تا حدود یک ساعت است.

برای تعیین میزان پروتئین، مانند سایر روشهای رنگ سنجی از نمونه استاندارد استفاده می شود که می تواند آلبومین یا گاماگلوبولین باشد. بهتر است ابتدا منحنی استاندارد را رسم نموده و محدوده خطی منحنی را تعیین نمود و سپس با توجه به آن غلظت پروتئین ناشناخته را بدست آوریم . برای افزایش محدوده خطی منحنی ( Linearity  )می توان جذب نوری تست و استاندارد را در هر دو طول موج nm 465   و nm 595  بدست آورده و مقدار A595-A465  را در فرمول به جای جذب تست و استاندارد قرار داد . باید توجه شود پروتئینهای مختلف محدوده خطی متفاوتی دارند. اگر پروتئین مورد اندازه گیری غنی از آرژنین باشد، باید استاندارد غنی از آرژنین برای مقایسه به کار گرفته شود. بهتر است نمونه در رقت های مختلف اندازه گیری شود و در محدوده خطي منحني استاندارد، غلظت محاسبه گردد. همچنین بهتر است برای هر رقت از نمونه، دو یا سه لوله تهیه شود و در نهایت میانگین جذب برای هر کدام در منحنی منظور شود.

حساسیت اين روش  در micro assay و  در macro assay است. تفاوت این دو روش در نسبت حجمی نمونه به معرف رنگ است.

کووتهای شیشه ای برای کار با پروتئینها مناسب نیستند چرا که پروتئین به آنها متصل می شود. لذا بهتر است از کووت های پلی استرن یکبار مصرف استفاده شود. مگر این که در هر بار مصرف کووت به دقت شستشو و وارسی شود . جهت شستشو میتوان از متانول در هنگام کار استفاده کرد ، پس از پایان کار برای استفاده مجدد میتوان کووت ها را در محلول اسید کلریدریک یک دهم نرمال چند ساعت قرار داد و سپس با آب و استون آبکشی نمود.

باید توجه نمود که محلول کوماسی به تنهایی غشاء سلولی را حل نمی کند پس باید قبل از شروع کار، کل سلول یا اجزاء غشایی توسط دترجنت ها یا الکل حل شود.

مداخله گرهای زیادی از جمله دترجنتها و فلاونوئیدها در آزمایش برادفورد تاثیر دارند که لیست آنها  به پیوست می باشد. در صورت عدم امکان حذف مداخله گر، می توان از رقیق کردن نمونه برای کاهش اثر آن استفاده کرد.

اگر نمونه پروتئین نا خالصی هایی مانند نوکلئیک اسید یا لیپید داشته باشد بهتر است از روشهای دیگر از جمله روش Folin Lowry برای اندازه گیری غلظت پروتئین استفاده شود.