الکتروفورز دو بعدی
یکی از روشهای موثر در جداسازی پروتیئنها از یکدیگر روش الکتروفورز دو بعدی (2-Dimentional, 2-D) است. در این روش ابتدا پروتئينها را بر اساس تفاوت در نقاط ايزوالكتريك جدا مي كنند. به اين مرحله Isoelectric focusing, IEF ميگويند. سپس با استفاده از روش SDS- PAGE و با توجه به خاصيت وزن مولكولي پروتئينها يك بار ديگر آنها را جداسازي مي‌كنند. با این روش می توان دو تا سه هزار نقطه مربوط به پروتئینها را در یک ژل cm 18×16 بدست آورد.
مرحله اول الكتروفورز دو بعدي را مي توان به دو روش انجام داد. يك روش بر پايه استفاده از Carrier ampholyte ها است كه روش قديمي محسوب مي شود. آمفوليتهاي حامل تركيب ناهمگوني از پليمر هاي سنتتيك هستند كه داراي گروههاي بافري اسيدي و بازي متعدد هستند. قرار گرفتن مخلوط آمفوليتهاي حامل در ميدان الكتريكي سبب حركت متفاوت آنها شده كه مي تواند در ساخت شيب pH مورد استفاده واقع شود.
امروزه استفاده از نوارهاي IPG (Immobilized pH gradient strips) بيشتر شايع است.
استفاده از نوارهای IPG تکرارپذیری 2-D را در حد قابل قبولی بالا برده است . هرچه از محدوده pH کوتاه تری در IPG ها استفاده شود ميزان جداسازي باندها افزايش خواهد داشت.
این روش در ترکیب با روشهای حساس رنگ آمیزی و روشهای آنالیز کامپیوتری تصاویر سبب ارتقائ سطح کارایی 2-D PAGE و تبدیل آن به یک تست رایج در آزمایشگاههای پروتئومیکس شده است. مراحل انجام آزمايش به شرح ذيل مي باشد.
مرحله اول: آماده سازی نمونه پروتئینی جهت آزمون الکتروفورز دوبعدی
در آزمایشات پروتئومیکس آماده سازی نمونه از اهمیت فوق العاده ای برخوردار است . به نحوی که می توان گفت رسیدن به نتیجه مطلوب تا حد زیادی به کیفیت نمونه بستگی دارد و سپس به نوع آزمایش .
هدف از فرآیند آماده سازی نمونه در حالت ایده آل پیش از آزمون الکتروفورز دوبعدی شامل موارد زیر است
⦁ شکستن اتصالات بین مولکولی و درون مولکولی پروتیئنها به نحوی که نهایتاً زنجیره پلی پپتیدی خطی بدست آید .
⦁ جلوگیری کردن از تغییرات شیمیایی در ساختار پروتئین . بطور مثال جلوگیری از تخریب پروتئینها توسط پروتئازها و یا تغییرات شیمیایی توسط فسفاتازها و غیره.
⦁ جداسازی ترکیبات اضافی از محیط . این ترکیبات مانند نمک ها و پلی ساکاریدها و لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک می توانندسبب تداخل در امر جداسازی پروتیئنها در آزمایش الکتروفورز گردند .
⦁ باقی نگهداشتن پروتئین در حالت محلول در طول فرآیند آزمایش.
برا ی شکستن باندهای دی سولفیدی اغلب از ترکیباتی که شامل تیول اضافی باشند استفاده می شود . در اوایل به کارگیری آزمون الکتروفورز دوبعدی استفاده از مرکاپتواتانول رایج بود . اما امروزه می دانیم که وارد شدن مرکاپتواتانل در ژل IEF سبب یونیزه شدن آن در pH بازی ( pH 9 ) در هنگام IEF شده و بنابراین سبب تخریب شیب pH می گردد. اما این مشکل در هنگام استفاده از DTT کمتر پیش می آید با این حال کاملا حذف نمی شود و در صورت استفاده مقادیر زیاد DTT ( بیشتر از mM 50 ) ممکن است تشدید شود . از طرفی پروتئینهایی که محتوای سیستئین آنها زیاد باشد و یا سیستئین با فعالیت زیاد داشته باشند با DTT کاملا خنثی نمی شوند . در چنین مواردی استفاده از فسفین توصیه می گردد. این ماده فعالیت بیشتری از DTT داشته و بنابراین مقدار بسیار کم آن ( در حد میلی مولار ) می تواند باندهای دی سولفیدی را بشکند و از طرفی برخلاف تیول ، فسفین توسط اکسیژن محلول کمتر خنثی می گردد.
از ترکیبات فسفین ، تری بوتیل فسفین به عنوان اولین ترکیب مورد استفاده بود . اما این ترکیب به دلیل ناپایدار بودن ، داشتن بوی تند وسمی بودن و نیاز داشتن به یک محلول آلی مانند پروپانل ، دی متیل سولفوکساید (DMSO ) و دی متیل فورمامید (DMF ) برای حل شدن در آب امروزه کمتر مورد استفاده است. اما امروزه فسفین محلول در آب، بنام تریس ( کربوکسی اتیل ) فسفین ، در دسترس بوده و ترجیحاً مورد استفاده قرار می گیرد .
یکی از راه های متداول شکستن باندهای غیرکووالانسی پروتئینها در آزمایشات پروتئومیکس استفاده از SDS است . این ماده به دلیل القای بار منفی به پروتئینها سبب شکسته شدن باندهای هیدروفوبی می گردد. اما در آزمون 2D- PAGE نمی توان از SDS استفاده کرد . چراکه بارمنفی اضافی با اساس جداسازی پروتئینها در مرحله IEF در تضاد است . به همين دليل استفاده از انواع ديگر دترجنت ها مانند CHAPS ، سولفوبتائين3-10 (SB 3-10) يا آميدوسولفوبتائين-14 (ASB-14) رايج است.
روش دیگر از بین بردن باندهای هیدروفوبی استفاده از مواد کائوتروپ (Chaortrope ) است . در واقع باید گفت که کائوتروپها قادرند ، تمام باندهای غیرکووالانسی، باندهای هیدروژنی ، هیدروفوبی و یونی را تحت تاثیر قرار دهند.
در 2-D معمولا ً از اوره (7-9 M) به عنوان کائوتروپ استفاده می شود. اما تیوره(2 M) نیز کائوتروپ دیگری است که قدرت دناتوره کردن آن بیشتر از اوره است اما به دلیل اینکه در آب کم حل می شود باید همراه اوره استفاده شود. تیوره در مواردی که جدا سازی پروتئین های هیدروفوب قوی مانند پروتئینهای غشایی و هسته ای مد نظر است بیشتر استفاده می شود.
مشکل استفاده از اوره اینست که در حرارت و pH بالا کربامیله می شود و تبدیل به آمونیوم سیانات می گردد. که سیانات می تواند با گروه آمین لایزین واکنش داده سبب تشکیل اوره جایگزین می شود. این واکنش بارهای الکتریکی را به هم زده و باعث بلاک شدن انتهای N می شود و در مس اسپکترومتری تداخل می کند. استفاده از scavenger Cyanate ها که حاوی آمین درجه اول هستند مانند Carrier ampholyte ها می تواند تا حدودی مشکل سیانات را حل کند. با اين حال استفاده از اوره کاملا ً خالص، سبب کاهش در میزان سیانات اولیه در ترکیب اوره می شود و توصيه مي شود. همچنین هرگز اوره را نباید بیشتر از 37 درجه حرارت داد چون تبدیل به سیانات می شود. محلول حاوی اوره نیز باید در 20- درجه نگهداری شود.
البته استفاده از کائوتروپهای غیریونی ( مانند اوره و تیوره ) زمانی که دانسیته بالای یونی در اطراف مولکولهای پروتئینی در اثر حضور اسیدهای نوکلئیک و هیستونها باشد قادر به شکستن باندهای یونی نمی باشند. در چنین مواردی می توان از تغییر pH در جهت افزایش حلالیت مولکولهای پروتئینی استفاده کرد . برای توجیه مکانیسم باید درنظر داشت که مولکولهای پروتئینی خود با دارا بودن عوامل اسیدو بازی ضعیف بصورت مولکولهای دوقطبی در pH فیزیولوژیک عمل می کنند . اما تغییر pH ، بطور مثال اضافه کردن تا حد 10 یا 11 می تواند سبب تحمیل بار منفی گردد که حضور بار منفی بر روی تمام مولکولهای پروتئینی سبب هم گریزی شده و سبب افزایش حلالیت می گردد.
در مواردی که پروتئین های خیلی هیدروفوب را می خواهیم بصورت محلول درآوریم استفاده همزمان از SDS و کائوتروپها را می توان انجام داد به شرط آنکه SDS را قبل از IEF رسوب داده و از ترکیب جدا کرد.
مرحله دوم: اضافه كردن نمونه به نوار IPG و رهیدریشن(Rehydration)
منظور از رهیدرشین، آب گیری مجدد نوار IPG است. در طي اين مرحله می توان ابتدا نمونه را به محلول لودينگ اضافه کرد و سپس نوار IPG را وارد آن نمود. در طول زمان رهيدريشن پروتئينهاي حل شده در بافر لودينگ، كه شامل تمام عواملي است كه براي شكستن باندهاي بين مولكولي لازمند، به نوار IPG اضافه مي شوند. همچنين برای انجام این مرحله می توان نوار را وارد بافر لودينگ به تنهایی كرد و رهیدریشن کرد و سپس در حد فاصل كوتاهي قبل از IEF نمونه را به آن اضافه نمود.
از مزایای روش اول اینست که این روش باعث جذب مقدار بیشتری از نمونه به نوار می شود، لذا نمونه را از دست نمی دهیم. این روش برای نمونه های خیلی رقیق مناسب تر است.
اما از معایب این روش اینست که در مواردی که آنزیمهای پروتئولیز کننده در نمونه حضور دارند ممکن است طول کشیدن مدت رهیدریشن سبب از دست رفتن پروتئین شود . در این موارد نمونه را بعد از رهیدریشن اضافه می کنند.
محلول رهیدریشن بصورت استوک تهیه شده در فریزر نگهداری می شود. اما ترکیباتی مانند DTTو Carrier amphalyte ها باید درست قبل از استفاده اضافه شود.
حجم نمونه نسبت به محلول نباید بیشتر از 1:8 باشد. معمولا ً برای محلول نمونه اضافه می شود. انتخاب میزان ترکیب نهایی بستگی به اندازه نوار دارد. میزان پروتئین بصورت تجربی و بسته به طول نوار، محدوده pH و روش سنجش (Detection) تعیین می گردد. اما تقریبا ً 1mg از پروتئین برای محدوده وسیع pH و نوار با طول کافی است.
محلول استاندارد رهیدریشن شامل موادي است كه بتوانند اتصالات بين مولكولي را برداشته (مانند اوره، دترجنتها و DTT) و pH را در حد مناسب حفظ نمايد ( مانند بافر (IPG.
مقدار دترجنت باید در حد 4-3 درصد باشد و باید از نوعی باشد که بار الکتریکی آن در IEF تداخل ننماید. معمولا ً از Triton X-100 وCHAPS و SB 3-10 و ASB-14 و یا Octyl glucoside استفاده می شود.
ترکیبات محلول به دلیل اشباع بودن دیرتر حل می شوند لذا باید زمان کافی برای حل کردن آنها در نظر گرفت. می توان محلول را کمی گرم کرد تا بهتر حل شود اما دما نباید از 30 درجه بیشتر شود چرا که دمای بالاتر باعث شکستن اوره می شود.
برای بعضی از پروتئینها می توان 10 درصد ایزوپروپانل و یا گلیسرول نیز به محلول اضافه کرد.
در مواردی که می خواهیم پروتئینهای هیدرفوبیک را جداسازی کنیم تیوره نیز به محلول اضافه می شود.
اگر بخواهیم پروتئین های سلولی (باکتری، مخمر، سلول جانوری) را برای 2-D مورد استفاده قرار می دهیم نیازمند یک محلول لیز کننده هستیم.محلولهای لیز کننده اغلب حاوی SDS هستند و SDS می تواند در میدان الکتریکی حرکت کرده و با تجمع در یک سمت نوار از حرکت پروتئینها جلوگیری کند. لذا هنگام استفاده از آن در لیز سلولی باید حداکثر غلظت SDS کمتر از %0.2 در محلول نهایی باشد.
نکاتی که در این مرحله باید رعایت گردد بدين شرح است.
سینی مخصوص آبگیری مجدد باید کاملا ً تمیز شود (با دترجنت) و آبکشی شده و خشک شود. پوشیدن دستکش الزامی است. از ایجاد حباب در محلول رهیدریشن به هنگام قرار دادن نوار جلوگیری شود.
برچسب پلاستیکی نوار به دقت برداشته شده نوار بصورتی که قسمت ژل دار آن رو به پایین باشد در محلول رهیدریشن قرار می گیرد.دقت شود تا سینی نمونه در سطحی کاملا ً مسطح قرار گیرد تا نمونه بطور یکنواخت در نوار پخش شود.
روغن معدني به نوار اضافه می شود تا از تبخیر نمونه و کریستالیزه شده اوره جلوگیری شود.
درپوش سینی گذاشته شده و نمونه در این حالت حداقل 10 ساعت رها می شود.
رهیدریشن در دمای آزمایشگاه انجام می شود دمای پایینتر از 20˚C باعث کریستالیزه شدن اوره می شود.
مرحله سوم:IEF (Isoelectic Focusing)
در این مرحله پروتئینها براساس نقطه ایزوالکتریک شان در جاهای مختلف ژل قرار می گیرند. اساس این روش اینست که پروتئینها در نقطه ایزوالکتریک بار كلي خنثی پیدا می کنند یعنی تعداد بارهای منفی و مثبت برابر می شود. این حالت زمانی ایجاد می شود که پروتئین در pH خاصی به نام PI قرار گیرد. نوارهای IPG طوری ساخته شده اند که گراديان مختلفی از pH در سطح خودشان دارند. بنابراین وقتی پروتئین به pH خاص خود یا PI می رسد در همان نقطه متوقف می شود.
مولکولهای آب در میدان الکتریکی تمایل به حرکت دارند و بنابراین به انتهای نوار IPG کشیده می شوند. برای اینکه این عمل سبب خشک شدن انتهای دیگر نوار نشود باید از نوارهای خیس کاغذی در دو انتهای نوار IPG استفاده کرد. این نوارها نباید خیلی خیس باشند و در حد فاصل IEF ممکن است هر یک ساعت یکبار آنها را عوض کنیم. این عمل از تجمع یونهای اضافی در یک سمت الکترود که ممانعت برای انتقال پروتئینها ایجاد می کنند را از بین می برد.
پس از مرحله IEF می توان نوار IPG را در بافر الکتروفورز (1×SDS ruming buffer) شسته (اگرچه این مرحله طبق تجربیات ما ضروری به نظر نمی رسد) و سپس بلافاصله برای مرحله بعدی مورد استفاده قرار داد یا در ذخیره کرد.
جلوگيري از رسوب پروتئينها در طي مرحله IEF
مشکل اصلی در صورتی که پروتئینها حلالیت کافی نداشته باشند زمانی بروز می کند که بخواهیم مرحله اول الکتروفورز دوبعدی یعنی IEF را انجام دهیم . در این مرحله به چند دلیل ممکن است پروتئینها رسوب نمایند .
⦁ پروتئینهایی که PI خیلی متفاوت از یکدیگر دارند و یا واکنشهای بین مولکولی میان پروتئینها و ترکیبات دیگر مانند اسیدهای نوکلئیک ممکن است سبب رسوب پروتئینها شوند .
⦁ در نقطه ایزوالکتریک ممکن است بدلیل خنثی شدن بار الکتریکی ، پروتئین به ماتریکس ژل بچسبد و رسوب کند.
⦁ در هنگام جذب شدن نمونه به ژل IEF به دلیل عبور فاز مایع از ژل و تاخیر در عبور پروتئینها ، سبب افزایش غلظت منطقه ای پروتئینها شده و این پدیده می تواند سبب رسوب پروتئینها گردد.
در پاسخ به این سوال که چرا نمی توان در هنگام IEF به مشکل رسوب شدن پروتئین فائق آمد باید گفت که دو محدودیت در این راه وجود دارد . یکی آنکه برای IEF مجبور به استفاده از محیط با قدرت یونی پایین هستیم . چراکه IEF باید در میدان الکتریکی با ولتاژ بالا صورت پذیرد و در چنین میدان الکتریکی نمی توان از موادی که قدرت یونی بالایی دارند استفاده کرد . فلذا در چنین محیطی نمی توان میانکنش های مولکولی را کاملا شکست و بنابراین احتمال رسوب وجود دارد . دوم آنکه IEF براساس شارژ طبیعی مولکولهای پروتئین می باشد و نمی توانیم شارژ اضافی ( مانند آنچه که در هنگام الکتروفورز یک بعدی با اضافه کردن SDS و دادن شارژ منفی به مولکولهای پروتئین بوجود می آید ) به پروتئینها تحمیل نمائیم . و بنابراین پروتئینها در چنین شرایطی تمایل به رسوب شدن دارند . برای درک اهمیت این موضوع باید توجه نمائیم که بصورت طبیعی نیز برا ی جلوگیری از رسوب پروتئینها در خون ، شارژ اضافی منفی توسط مولکولهای آلبومین تامین می گردد.
بنابراین انتخاب ماده جهت محلول سازی پروتئین پیش از الکتروفورز دوبعدی باید طوری باشد که از طرفی قادر به شکستن کلیه باندهای دی سولفیدی ، هیدروفوبی ، هیدروژنی ، واندروالس و یونی باشد ( این باندها اغلب پروتئین را از حالت خطی به صورت تابیده شکل می دهند ) و از طرفی این ماده باید با مرحله IEF سازگار باشد .
مرحله چهارم: الکتروفورز بر روی ژل SDS
اين مرحله اساسا مشابه الكتروفورز يك بعدي (SDS-PAGE) است با اين تفاوت كه در اين مرحله مولكولهاي پروتئين به جاي حضور در بافر لودينگ بر روي نوار IPGقرار دارند. در اين مرحله ميتوان بر خلاف مرحله IEF از SDS استفاده كرد. به همين دليل پيش از انجام، نوار را در بافر تعادل (Equilibration buffer) حاوي SDS قرار مي دهند. ترکیبات اين بافر مي تواند شامل: تریس، اوره، گلیسرول، SDS و برم فنل بلو باشد.
علاوه بر اين از اهداف اين مرحله شکستن باندهای دی سولفیدی باقی مانده است. اين كار را مي توان با اضافه كردن DTT به بافر انجام داد. همچنين براي آنكه باندهاي دي سولفيدي شكسته شده مجددا تشكيل نشوند بايد آنها را بلاك نمود. براي اين كار با اضافه كردن آيودو استامايد (Iodoacetamide) مي توان گروههاي سولفيد به جا مانده را متيله كرد.
10ml از بافر تعادل برای نوار 18cm مناسب است. این مرحله را در تیوب در مدت زمان 15 دقیقه می توان انجام داد.
تعادل رسانی در دو مرحله انجام می شود مرحله اول مطابق بالا و در مرحله دوم از یودو استامید به جای DTT استفاده می شود بقیه مراحل مانند مرحله اول است.
مرحله الکتروفورز SDS دقیقا ً مطابق روش SDS معمولی است فقط در اینجا ژل Stacking به بالای ژل اضافه نمی شود. مگر در حالتی که بخواهیم از مارکر محلول استفاده کنیم.
برای اینکه نوار را به راحتی روی ژل قرار دهیم بهتر است نوار را با بافر running کمی خیس کنیم . باید تلاش کرد از ایجاد حباب بین نوار و ژل جلوگیری شود. می توان مارکر را روی فیلتر کاغذی بلات کرد و مانند نوار الکتروفورز نمود.
بهتر است نوار با 1% آگارز پوشیده شود.اما باید دقت نمود که دمای آگارز هنگام اضافه کردن خیلی بالا نباشد.
بايد توجه نمود كه الکتروفورز در این حالت (نوار) خیلی بیشتر از الکتروفورز معمولی طول خواهد کشید و در اين شرايط جلوگيري كردن از افزايش دماي بافر الكتروفورز اهميت دارد.

تصوير : الكتروفورز دو بعدي پروتئينهاي بدست آمده از ليز سلولي سلولهاي RBL . رنگ آميزي نقره. (Ref: Sadroddiny et al, Cell Biology International, 2011)
محدودیت های 2-D
الكتروفورز دو بعدي تا مدتها به عنوان متد اصلي در آزمايشات پروتئوميكس مورد توجه بوده است. با اين حال محدوديتهايي هم دارد كه كاربرد گسترده آن را مهار كرده است. از جمله مهمترين محدوديتهاي اين روش تكرار پذيري پايين آن است. بهبود روشهاي آماده سازي نمونه و استفاده از نوارهاي IPG به نحو قابل توجه اي اين محدوديت را كاسته است اما هنوز وجود دارد. براي مثال در مرحله آماده سازی نمونه، اگر دناتوراسیون(Denaturation) به طور کامل انجام نشود پروتئینهای موجود در ساختار یک کمپلکس مولکولی ممکن است بصورت متصل به هم باقی مانده و در هنگام الکتروفورز بصورت یک خط دیده شوند و نه بصورت نقاط جدا از هم.
همچنين حداکثر تعداد نقاط قابل جداسازي در شرایط عالی حدود 3000 نقطه است در حالی که در یوکاریوتها انتظار می رود بسیار بیشتر از این تعداد انواع پروتئین وجود داشته باشد. اين موضوع مي تواند تا حدودي نيز مربوط به مقدار نسبي پروتئينها در نمونه باشد. بیان متفاوت انواع پروتئینها باعث پوشیده شدن پروتئین کمتر بیان شده با پروتئین بیشتر بیان شده می شود. و این نیازمند بخشبندي (Fractionation) است.
همچنين ممكن است پروتئينهاي با خواص PI و MW يكسان روي هم افتاده باشند.
علاوه بر اين يكي از مهمترين محدوديتهاي 2D ، ناتواني آن در جداسازي پروتئينهاي بسيار هيدروفوب است. همچنين پروتئينهاي با وزن مولكولي بسيار بالا يا پايين در 2D به درستي جداسازي نمي شوند.