روش Matrix Assisted Laser Desorption Ionization , MALDI

این روش یونیزاسيون یک روش مناسب برای ترکیبات آلی غیر فرار ( Non – volatile ) و مقاوم در برابر حرارت (    Termolabile ) مخصوصاً ترکیبات با وزن مولکولی بالاست . کار با دستگاه MALDI نسبتاً آسان و مزیت ویژه آن تحمل نسبتاً بالای آن نسبت به حضور ترکیبات اضافی مانند یونهای فلزی در نمونه است . میزان دقت بستگی به نوع دستگاه دارد اما تا حد 01/0 % وزن مولکولی را به دقت نشان می دهد .

روش MALDI بر اساس بمباران مولکولهای نمونه توسط لیزر و تبدیل آنها به حالت یونیزاسیون است.  در اغلب دستگاههای     MALDI از لیزر نیتروژن فركانس دار با طول موج nm 337 استفاده می شود . در این روش از ترکیباتي به عنوان ماتریکس استفاده می شود که به همراه نمونه در قسمت یونیزاسیون قرار داده  می شود . مولکولهای ماتریکس خاصیت جذب بالای انرژی لیزر رادارند و قادرند انرژی دریافتی را به صورت انرژی تهییج کننده ( Excitation energy  ) به مولکولهای نمونه منتقل کنند . این کار از تخریب مولکولهای نمونه در اثر برخورد مستقیم لیزر جلوگیری می کند .

نمونه آزمایش ابتدا با یک حلال فرار ( که بطور مثال در یونیزاسيون مثبت تری فلورواستیک اسید است ) و در غلظت مناسب ( مثلاً pmol / ml10 – 1 ) ترکیب می شود و سپس µl2- 1 از این ترکیب برداشته و يا مقدار مساوی از ماتریکس ترکیب می شود و  نمونه گذاری انجام می شود . پیش از تابش لیزر باید نمونه خشک شده باشد . ترکیبات زیادی به عنوان ماتریکس مورد آزمون قرار گرفته است. انتخاب نوع ماتریکس می تواند یونیزاسیون ماده، تشکیل adduct و پایداری ماده مورد سنجش را تحت تاثیر قرار دهد. قانون مشخصی برای انتخاب ماتریکس مناسب وجود ندارد و تنها می توان آنها را بر اساس داشتن خاصیت جذب لیزر انتخاب نمود. با اینحال قابلیت آن برای حل کردن ماده مورد سنجش، پایداری در حالت خلاء و بی اثر بودن آن از خصوصیاتی است که باید مد نظر واقع شود.

یک قانون مهم آن است که اغلب ماتریکس ها برای آنالیز تمام انواع مواد مناسب نیستند. در آنالیز پپتیدها اغلب از ترکیبات سینامیک اسید  به خصوص α – cyano – 4-hydroxycinnamic acid, CHCA به عنوان ماتریکس استفاده می شود.

ترکیب دیگری که ابتدا در آنالیز پروتئین کامل مورد استفاده واقع شده است سیناپینیک اسید ( SINA ) است . همچنین از ترکیبات بنزوئیک اسید مانند dihydroxybenzoic acid , DHB –  5 و 2 برای آنالیز مواد با وزن مولکولی پایین و پروتئینها و گلیکوپروتئینها استفاده می شود.

پلی هیدروکسی استوفنونها شامل گروههای اسیدی ضعیف هیدروکسیل هستند واغلب در آنالیز مولکولهای اسیدی ناپایدار مانند اولیگو نوکلئوتیدها مورد استفاده واقع می شوند.

برخي از مواد مورد استفاده به عنوان ماتريكس، خصوصيات و موارد كاربرد آنها در جدول 1

 آمده است.

به همراه MALDI اغلب از آنالایزرTOF Flight) – of – (Time استفاده می شود که بر اساس زمان رسیدن ذرات یونیزه از مرکز یونیزان به دتکتور می تواند نسبت m / z را محاسبه و اندازه گیری نماید .

برای کالیبراسیون دستگاه می توان از نمونه های شناخته شده ( مانند پپتیدهای سنتتیک با وزن مولکولی مشخص ) استفاده کرد که ممکن است بصورت یک نمونه مجزا و یا از پیش مخلوط شده با نمونه و ماتریکس مورد ارزیابی قرار گیرد .

روش MALDI یک روش یونیزاسیون نرم به حساب می آید . لذا اغلب مولکولها فارغ از اندازه و وزن مولکولی ذره بصورت تک بار یونیزه می شوند . بنابراین تفسیر اسپکترای بدست آمده از این روش نسبت به روش ESI آسانتر است . همچنین قطعه – قطعه شدن ذرات در طول فرایند یونیزاسیون اغلب اتفاق نمی افتد . با وجود غالب بودن اسپکترای ذرات تک بار ممکن است اسپکترای ذرات ، اضافه شدن نمک و اشکال دایمر نمونه نیز دیده شود .

جدول1  : ماتريكسها ، خصوصيات و موارد مصرف آنها. (Ref: Jörge von Hagen, Proteomics sample preparation)

Main application	Melting point/c	Color	Molecular weight/[g mol-1]	Elemental formula	Name	Common abbreviation of matrix
Oligonucleotides	219-221 ( decomp)	White	139.11	C6H5NO3	3-Hydroxy-picolinic acid	3-HPA
Oligonucleotides	218-219	White	143.17	C4H5N3OS	6-Aza-2-thiothymine	ATT
Oligonucleotides	156-158	White to pale yellow	152.15	C8H8O3	Dihydroxyacetophenone  2.6,	DHAP
Different analytes: Peptides, proteins Glycoprotein’s, Phosphopeptides, Organic molecules	205 ( decomp)	white	154.12	C7H6O4	2.5- Dihydroxy-benzoic acid	DHB
Proteins	168-171	White	194.19	C10H10O4	4-Hydroxy-3methoxycinnamic acid	Ferulic acid
Peptides and polymers	205-207	Orange	242.23	C13H10N2O3	2-(4/-Hydroxyphenylazo)-benzoic acid	HABA
Peptide Mixtures	250-253 ( decomp)	Yellow	189.17	C10H7NO3	α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	CHCA
As additive to DHB forming DHBs	141-143	white	168.15	C8H8O4	2-Hydroxy-5-methoxy  benzoic acid	HMBA
Not vacuum stable	158-161	White	138.12	C7H6O3	Salicylic acid	SA
proteins	203-205	white	224.21	C11H12O5	Sinapic acid 3,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid	SINA
Oligonucleotides	219-221	White to pale yellow	186.17	C8H8O4-H2O	2,4,6-Trihydroxyacetophenone	THAP

 Decomp: Decomposition

جدول2 : ماتريكسها و روش استفاده از آنها (Ref: Jörge von Hagen, Proteomics sample preparation)

Possible matrix solvents and concentrations	Possible preparation protocol	Name	Matrix
50 mg ml -1 in acetonitrile/ water(1:1)25 mg ml-1 .in methanol /water(1:1) 25 mg ml -1 .in ethanol/water(1:1) 25 mg ml-1 in water	Cocrystallization	3-Hydroxypicolinic acid	3-HPA
10 mg ml-1 in acetonitrile/water(1:1)	Cocrystallization	6-Aza-2-thiothymine	ATT
10 mg ml-1 in acetonitrile/water(1:1)	Cocrystallization or Surface preparation	2,6-Dihydroxyacetophenone	DHAP
10mg ml-1 in ATW	Cocrystallization	2,5-Dihydroxybenzoic acid	DHB
20 mg ml-1 DHB with 10% HMBA in ATW	Surface preparation	‘ super DHB2’ ( mixture of DHB with 10% HMBA)	DHBS
8mg ml-1 in water 8mg ml-1 in TFA/acetonitrile/water(1:1:2)	Cocrystallization	4-Hydroxy-3- methoxycinnamic acid	Ferulic acid
2.5 mg ml-1 in water/acetone(1:1)	Surface preparation	2-(4/-Hydroxy-phenylazo)- benzoic acid	HABA
40 mg ml -1 in acetone 5 mg ml -1 in ATW	Surface preparation or Cocrystallization	α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	CHCA
20 mg ml-1 in ATW	Cocrystallization	Salicylic acid	SA
10 mg ml-1 in ATW	Surface preparation oder Cocrystallization	Sinapinic acid 3,5-Demethoxy-4-hydroxycinnamic acid	SINA
10 mg ml-1 in acetonitrile / water(1:1)	Cocrystallization or surface  preparation	2,4,6-Trihydroxyacetophenone  hydrate	THAP

ATW. 0/1% TFA in water/acetonitrile( 1:1 ): DHB, 2,5 – dihydroxybenzoic acid :

HMBA , 2-hydroxy – 5 – methoxy – benzoic acid : TFA , trifluoroacetic acid.

اغلب در آنالیز پروتئین و پپتیدها از یونیزاسیون مثبت و در الیگونوکلئوتیدها و الیگوساکاریدها از یونیزاسیون منفی استفاده می شود .

انتخاب حالت یونیزاسیون بستگی به گروههای عاملی مولکولهای مورد سنجش دارد . مولکولهای پروتئینی به دلیل داشتن گروههای آمینی وکر بوکسیلی در هر دو حالت می توانند مورد سنجش قرار گیرندکه البته بیشتر در حالت مثبت بررسی می شوند . در مقابل مولکولهای قندی به دلیل داشتن گروههای هیدروکسیلی به راحتی در حالت منفی مورد سنجش قرار می گیرند .